日本でDIYbioを始めるにあたって…… 最初から mode ＠バイオハッカージャパン掲示板

日本でDIYbioを始めるにあたって……
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21 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/02/05(火) 01:07]
＞この手の装置を使って良い結果を得るには、相応の知識とテクニックが必要 そうなんですかあ。 宣伝写真は浜辺で片膝付いて操作する姿なのでだまされました。 そもそも植物の場合細胞壁が有るから 粉砕という最初の段階はどうなるのかが疑問でした。 受託会社に材料を渡して試し泳動をやってもらった時に 配列が得られるか確定的でないので失敗した時の料金云々の話でした。 ＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊＊ 話がずれますが、 実験分担係に近所の主婦を雇って訓練してというUSAで昔聞いたやり方が つくばや医学部では10年前から始まっておりますね。 職安でもバイテク分野の実験補助の求人が医学部からしょっちゅう出ております。 ということは、 私が実験法の参考書や対象属の論文のM&Mを勉強してきて こりゃかなわんと感じるほど細かな手技の段階と別法の多さから考えて、 自分に適した手技の決定のむつかしさと慣れるまでの期間を考えると 未経験者が自宅で全工程を本当にできるのか との疑いが起きつつあります。
22 ) nmu(aka)
[2019/02/05(火) 02:31]
minionについては以下にレビューがあります。 https://tenure5.vbl.okayama-u.ac.jp/HM_blog/?p=3670 専門家でも「結構わかりにくいマニュアル」「解読の精度は低く」（現状では）などのコメントからも、難しい装置であることがわかります。 >そのPCRがprimer設計なんてのが挟まるので面倒さが相当と感じ、 "Phylogenetic relationships of some European Gelidium (Gelidiales, Rhodophyta) species, based on rbcL nucleotide sequence analysis"というタイトルの論文が公開されています。 この論文のTable2にプライマーが載っているので、そのまま使えるかもしれません。 しかしながら、 >未経験者が自宅で全工程を本当にできるのか まさにそこが一番難しいところだと思います。このスレッドの最初に挙げられているDIYbioの問題点の一つだと思います。
23 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/02/07(木) 21:59]
minion情報をありがとうございました。ペケですね。 プライマ一覧の論文はscholarで見つけて読んだことが有ります。 ところでここの主催者自身のやっておることは 機械工学系つまり装置の組み立てですよね。 私は若いころはハムの、特に送信機の、組み立てを アルミシャーシーに穴をあける段階から楽しんでおりましたが、 それと同じです。水を使いませんから楽やし バイテクのDIYとは違うやんかと言いたい。 未経験者が始める場合の手技の調査でうんざりさせられる 「wet手技」の工程数の多さが問題なのです。 ここの主催者が自分でやったとして紹介画像を挙げておる景色には wet手技は有りません。工作場面ばかり出してあります。 あ～ぁ、練習で消費する費用を考えるとやはり 植物を渡して2遺伝子8万で配列まで完全委託が合理的ですね。 実験補助員として就職する気が無ければ、ね（＾￥＾） 研究費に応募可能な財団はすべて抽出してあり、 これからシーズンなので申請書書きが大変。 でも日本は年齢差別が常識なので 要項に書いて有らずとも落とされる覚悟で応募せねばなりません（＾￥＾）< <省略> [全文]
24 ) student(aka)
[2019/02/12(火) 14:32]
ウェット実験手法のノウハウをウェブで公開している人は確かにいませんね。 細胞培養ならShojinmeatの方々がアップしていますが、DIYのDNAワークは日本だとあまりやられていないかも。 以前にYCAMの「森のDNA図鑑」プロジェクトでrbcL遺伝子のシーケンスを行なっていたので、練習次第で個人でもできるとは思います（解析結果をみるに、精製度に難はありそう）。 https://special.ycam.jp/dna-of-forests/#/chuo-park/panorama/s-24 ウェブじゃなくても良いなら、バイオ実験イラストレイテッドシリーズという本がおすすめですよ。 DIYバイオではないので、試薬と機器の調達を工夫しなければいけませんが。 自分がDIYで泳動実験するとしたら、下記の要領でチャレンジする気になるかなどうかという感じです。 1. DNAの抽出 ・株式会社リーゾで販売しているキットを用いる（アマゾンから購入） http://biohacker.jp/c/BH64.html 2. PCR ・サーマルサイクラーをOpenPCRから購入（自作できるなら自作） ・プライマーはBioneer社から購入 http://biohacker.jp/c/BH53.html ・DNAの精製度が悪いと思うので、泳動後、目的バンドが出 <省略> [全文]
25 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/02/20(水) 17:59]
バイオ実験イラストレイテッドは3巻とも所有しており、 しっかり読んで手順を書き出しました。 ＞上記には挙げなかったピペットマンとか、オートクレーブ機器とか 雑多に色々必要ですので、 初期費用とランニングコスト共に結構かかりそう。 「雑多に色々」が当分野が困ったちゃんな原因ですね。 10年位前の集中して実験手技の調査をしておりました時に 知恵袋あたりでDIYに必要な一式費用を尋ねたら 200万との答えをもらったことを思い出しました。 この額に納得しかけておる今日この頃です。 10年間民間財団の助成が当たりすぎて（非道都市は3件同時で計200万） 琉球の分布調査で野帳で旅行記を出版する計画なほど遊び過ぎまして、 10年ぶりに手技の勉強に戻ったらほとんど忘れておりまして 論文用には植物を渡しての全面委託で配列まで、にほぼ決めております。 しかし泳動装置はもったいなくて 市のゴミ回収に出すわけには行きませんので 何とか最低水準の、泳動距離比較だけでならば DIYで遊べるのではと思ってお尋ねしております。 しかし制限酵素処理とPCRがねえ、メンドクサイなあと。 <省略> [全文]
26 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/02/20(水) 18:03]
丸投げ先はリーゾですよ。 寒天分という恐怖の粘質多糖が多量のテングサなので 試料を送ってbandが出るかやってもらったことが有りましたが、 かすれた像のゲルを多量に送ってくれました。
27 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/02/20(水) 18:08]
＞リーゾで販売しているキットを用いる これはむかしそそられましたが、 完品かと思いきや 溶媒系が数種含まれておらぬ故、 別に自分であつらえねばなりませんのでがっかりです。 どうしてこう障害続きなのか、プンプン
28 ) 助さん(aka)
[2019/03/06(水) 22:08]
何か勘違いをなさっていませんか？ PCR無しでcrudeなgenomic DNAを泳動して、どうやって特定の遺伝子の多形を調べるおつもりか？
29 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/03/12(火) 17:12]
あ、いや、計画を細かく述べる必要は無いので端折りました。 精製や増幅の各段階を増やして行って経験を増やしつつ 様子を見る計画なんですよ。 ｒｂｃLなどの多型は、技術の信頼度の点で後日 植物試料を渡して抽出から配列決定までのまるごと会社に委託します。 目下、初めて遊びで泳動を実施するので初心者用として 小学生用の核酸抽出実験で得たものを一旦泳動して どうなるかに関心があります。 得たDNAを割りばしで巻き取ると書いて有るので そのままでは分子が巨大すぎて泳動に不適かな⇒ 熟練者様のようなので結果の推定をお尋ねします。
30 ) 助さん(aka)
[2019/03/12(火) 18:50]
「小学生用の核酸抽出実験」がどのようなものか正確にはわかりませんが、 巻取り法で精製したDNAを通常のアガロースゲル電気泳動にかけたら かなり上方にバンドが出て上下にスメアを引くでしょう。 タンパク質や多糖が十分に除かれていないなら、ウェルに留まってゲルに入って行かない 画分が増えるでしょうね。
31 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/03/13(水) 03:55]
実施するまでも無くそれが予想できるわけですね。 では経験するまでも無いので止めます。 ご教示に感謝します。 制限酵素処理とPCRとの前後関係が逆転した手法が 実験書に載っておりますが、どういうことかご解説願えますか。 他方、 rapd, aflp, rflpはすべて欠点だらけなので旧式らしいですが 費用、労力、習得時間、data量、信頼性、解像度について優れた点が多い 「新しい」やり方は何ですか。MASAはかなり良さそうですね。 最後に、PCRをせずに済むことは大雑把に言えば「無し」ですか。
32 ) 助さん(aka)
[2019/03/13(水) 11:06]
うーん、おっしゃっていることがよくわかりません。 まず、私が書いたようなことが予想できるなら、とのことですが、そうでないなら例えばどのようなことを想定されていたのですか？ 制限酵素処理とPCRの順序が逆転とは？実験の目的によってどちらもあり得るでしょう。それは手法云々の問題じゃないと思いますが。 「新しい」やり方とは、「何の」やり方でしょうか？おかきになっているfour letter wordが何を指すか私には自明ではありません。 「PCRをせずに済む」とは、何をするためにの話でしょうか。種の類縁関係を調べるなら、配列決定は必須でしょう。全ゲノムを決定したいというのでなければ、PCRによって当該遺伝子を増やすのが一番簡単な方法なので、それを回避する理由がわかりません。 総じて実験方法に関する"遠近法"が通常とは違っている印象があります。身近に方法について相談できる方はいませんか？
33 ) あ(aka)
[2019/03/13(水) 17:13]
全体的に情報が不足しているんですよね。 個人的にはご専門ではないせいで情報の取捨選択が上手くできておらず、やりたいことが先走ってはしょりすぎた話し方になっている印象を受けます。 最終目標は何か、そのために何がしたいのか・何が欲しいのかをできる限り詳細に書いてほしいですね。 これでも見たんですかね？ https://www.jstage.jst.go.jp/article/kagakutoseibutsu1962/37/5/37_5_345/_pdf/-char/ja なんというか、バイオハックしたい人たちは総じて研究というよりは実験をしたい人たちって感じがします。
34 ) あ(aka)
[2019/03/13(水) 17:50]
MASA法ってこれですか？ http://journal.jsgs.or.jp/pdf/030040897.pdf かるーくイントロ読んだだけですけど、「3'末端が特異的になるようなプライマーを用いて厳密な条件設定の下にPCRを行うと」って書いてあります よく分からなくなったんですが、そもそも何がしたいんでしたっけ？ 遡って読んだ感じ、いろんな天草のRCBL領域の塩基配列を比較したいだけ？ それってゲノム取ってきてRCBL領域よりちょっと広くPCRかけて、PCR産物をシーケンス解析に出して届いたデータ解析するだけじゃないんですか？ なんでこんなに難しい話してるんですか
35 ) student(aka)
[2019/03/15(金) 13:39]
>制限酵素処理とPCRとの前後関係が逆転した手法 genomic DNAの多型をみる場合、そもそも制限酵素処理は必要ないと思います。 （genomic DNAに制限酵素サイトあるような特殊な場合を除いて） >何とか最低水準の、泳動距離比較だけでならば >DIYで遊べるのではと思ってお尋ねしております。 と25レス目ありますので、スプライシングバリアントとかなんですかね？ cDNAの長さが結構違うならcDNAとるだけでも比べられるかもしれませんよ。 まずは市民団体が主催のDIYバイオのハンズオンなどに出てみると、どのように実験するのが良いか明確になってくるかな、と思います。 http://bioclub.org/ （BioClubの回し者というわけではないのですがｗ）
36 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/03/22(金) 05:10]
少し発言が貯まりましたね。 ＞genomic DNAの多型をみる場合、そもそも制限酵素処理は必要ない この意味は粗抽出後に断片化させる必要は無い、と受け取りましたが、 そうならば、 前に小学生用の実験書でバナナとブロッコリとのDNA抽出を読みましたが この水準の粗抽出で得たDNAを泳動しても bandは一本しか出ぬとの意見をもらいました。 ＞市民団体が主催の 前にも無料のそれを調べましたが 数年ぶりに検索して10件くらいに 来年度の実施予定を尋ねたら 続々とかなり高額の有料になっておりました。 「あ」さん、 配列については海藻試料を渡して完全委託にします。 未使用のmultiphor II＋電源を所有しておるもので 捨てるにはもったいなさすぎると考え、 移動度の差で遊び実験したいなと考えたので 方々で質問しまくっております。 rbcLなどの1kｂｐ以下の断片を得てPCRする場合に primerと制限酵素とが関係するのか否かが 未だによくわかりません。 ＞PCRかけて 制限酵素とprimer設計なんぞと言う なんか面倒な手技が絡んでくるようなので 細かく疑問点を聞きまくる羽目に。< <省略> [全文]
37 ) あ(aka)
[2019/03/22(金) 09:16]
自分でも何がしたくて何をしなきゃいけないのか分かってないんだったら、独学なんて金も時間も浪費するやり方はやめたほうがいいですよ
38 ) student(aka)
[2019/03/22(金) 16:01]
>移動度の差で遊び実験 もしかして、制限酵素断片長多型を見ようとしてますか。 RFLPは検出にプローブが必要なので、自宅で検出するのは厳しそうな気がしますね。 「genomic DNAの多型をみる場合、そもそも制限酵素処理は必要ない」というのは、ゲノムDNA中の配列をPCRで増幅し、PCR産物をシーケンスにかけることを指したつもりで言いました。 この時には制限酵素処理などはいらないです。ゲノムDNAを鋳型にPCRをかけるのみ。 （PCR産物をサブクローニングするとかならDNAワーク必要ですが） 「海藻試料を渡して完全委託」はこのことだと思います。 ゲノムDNAを渡しても多分なにも結果が得られませんよ。 >自分でも何がしたくて何をしなきゃいけないのか分かってないんだったら、独学なんて金も時間も浪費するやり方はやめたほうがいいですよ これを学ぶために、一度市民団体のハンズオン出るのもありな気がしますね。 業者に解析依頼すると結構お金かかると思いますし、そこのコストは自分の勉強だと思ってとってもいいのでは？
39 ) ｈｊｎ(aka)
[2019/03/23(土) 04:52]
読んだ文献にRAPD　RFLP　AFLPはどれも旧式で欠点だらけであると有る物が有りました。 また DNAレベルでニンジン生薬の識別のために 簡易で再現性のある方法を開発することを目的として， 3種間の18S rRNA遺伝子塩基配列決定の違いをベースとした， PCR-RFLP法とMASA法を適用した． MASAはPCR機械と電気泳動装置ならびに反応試薬があれば比較的簡単であって、 適切なPCRプライマー設計とPCR条件の基礎検討を十分行なえば 再現性のよい高精度の結果が得られる（関谷1997）というのも。 面倒でない=step数が少ないのが良いのでMASAに気をひかれます。 私がやろうとしておることは用語を使えばRFLPですね、 ｒｂｃL、matK、ND5、COI、nrITSについての。 primerでうんざりしておるのにprobeなんてのも出てきましたかあ。 ＞市民団体のハンズオン出るのもありな気がしますね。 そこのコストは自分の勉強だと思 たしかにね、とにかく手を動かさねば理解できませんから。 大学や国研でも無料で数年前にやってましたが、 来年度に有料に成るのは8千円と2万円とが明らかになっております。 無料のが6件くらいです <省略> [全文]
40 ) 助さん(aka)
[2019/03/23(土) 12:06]
根本的な考え違いをされているようです。高等植物のゲノムサイズはどのくらいだとお思いですか？ 通常のアガロースゲル電気泳動で分別することのできるDNAのサイズはどのくらいのレンジかご存知ですか？ それを典型的な制限酵素で切断したいくつに切れるか計算してみてはいかがでしょうか。 通常のDNAの電気泳動が目的なのだからMultiphor IIのことはもうお忘れになった方が良いですよ。 皆さん、何度もご指摘になっているのに、なぜそこに執着されるのでしょうか。 primerと制限酵素？PCR産物でRFLP解析するということですか？ RFLPは種内の系統解析には使えるでしょうが種間で比較しても意味があるとは思えません。 配列解析一択でしょう。 これらは目的とされている実験のデザインでは基礎の基礎であって、体で覚えるなどといったこととは無縁の話です。 悪いことは言いませんからプロと共同研究をなさることをお勧めします。

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