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日本でDIYbioを始めるにあたって…… |
- 31: ｈｊｎ:2019/03/13(水) 03:55
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実施するまでも無くそれが予想できるわけですね。
では経験するまでも無いので止めます。
ご教示に感謝します。
制限酵素処理とPCRとの前後関係が逆転した手法が
実験書に載っておりますが、どういうことかご解説願えますか。
他方、
rapd, aflp, rflpはすべて欠点だらけなので旧式らしいですが
費用、労力、習得時間、data量、信頼性、解像度について優れた点が多い
「新しい」やり方は何ですか。MASAはかなり良さそうですね。
最後に、PCRをせずに済むことは大雑把に言えば「無し」ですか。
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- 32: 助さん:2019/03/13(水) 11:06
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うーん、おっしゃっていることがよくわかりません。
まず、私が書いたようなことが予想できるなら、とのことですが、そうでないなら例えばどのようなことを想定されていたのですか？
制限酵素処理とPCRの順序が逆転とは？実験の目的によってどちらもあり得るでしょう。それは手法云々の問題じゃないと思いますが。
「新しい」やり方とは、「何の」やり方でしょうか？おかきになっているfour letter wordが何を指すか私には自明ではありません。
「PCRをせずに済む」とは、何をするためにの話でしょうか。種の類縁関係を調べるなら、配列決定は必須でしょう。全ゲノムを決定したいというのでなければ、PCRによって当該遺伝子を増やすのが一番簡単な方法なので、それを回避する理由がわかりません。
総じて実験方法に関する"遠近法"が通常とは違っている印象があります。身近に方法について相談できる方はいませんか？
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- 33: あ:2019/03/13(水) 17:13
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全体的に情報が不足しているんですよね。
個人的にはご専門ではないせいで情報の取捨選択が上手くできておらず、やりたいことが先走ってはしょりすぎた話し方になっている印象を受けます。
最終目標は何か、そのために何がしたいのか・何が欲しいのかをできる限り詳細に書いてほしいですね。
これでも見たんですかね？
https://www.jstage.jst.go.jp/article/kagakutoseibutsu1962/37/5/37_5_345/_pdf/-char/ja
なんというか、バイオハックしたい人たちは総じて研究というよりは実験をしたい人たちって感じがします。
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- 34: あ:2019/03/13(水) 17:50
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MASA法ってこれですか？
http://journal.jsgs.or.jp/pdf/030040897.pdf
かるーくイントロ読んだだけですけど、「3'末端が特異的になるようなプライマーを用いて厳密な条件設定の下にPCRを行うと」って書いてあります
よく分からなくなったんですが、そもそも何がしたいんでしたっけ？
遡って読んだ感じ、いろんな天草のRCBL領域の塩基配列を比較したいだけ？
それってゲノム取ってきてRCBL領域よりちょっと広くPCRかけて、PCR産物をシーケンス解析に出して届いたデータ解析するだけじゃないんですか？
なんでこんなに難しい話してるんですか
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- 35: student:2019/03/15(金) 13:39
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>制限酵素処理とPCRとの前後関係が逆転した手法
genomic DNAの多型をみる場合、そもそも制限酵素処理は必要ないと思います。
（genomic DNAに制限酵素サイトあるような特殊な場合を除いて）
>何とか最低水準の、泳動距離比較だけでならば
>DIYで遊べるのではと思ってお尋ねしております。
と25レス目ありますので、スプライシングバリアントとかなんですかね？
cDNAの長さが結構違うならcDNAとるだけでも比べられるかもしれませんよ。
まずは市民団体が主催のDIYバイオのハンズオンなどに出てみると、どのように実験するのが良いか明確になってくるかな、と思います。
http://bioclub.org/
（BioClubの回し者というわけではないのですがｗ）
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- 36: ｈｊｎ:2019/03/22(金) 05:10
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少し発言が貯まりましたね。
＞genomic DNAの多型をみる場合、そもそも制限酵素処理は必要ない
この意味は粗抽出後に断片化させる必要は無い、と受け取りましたが、
そうならば、
前に小学生用の実験書でバナナとブロッコリとのDNA抽出を読みましたが
この水準の粗抽出で得たDNAを泳動しても
bandは一本しか出ぬとの意見をもらいました。
＞市民団体が主催の
前にも無料のそれを調べましたが
数年ぶりに検索して10件くらいに
来年度の実施予定を尋ねたら
続々とかなり高額の有料になっておりました。
「 あ」さん、
配列については海藻試料を渡して完全委託にします。
未使用のmultiphor II＋電源を所有しておるもので
捨てるにはもったいなさすぎると考え、
移動度の差で遊び実験したいなと考えたので
方々で質問しまくっております。
rbcLなどの1kｂｐ以下の断片を得てPCRする場合に
primerと制限酵素とが関係するのか否かが
未だによくわかりません。
＞PCRかけて
制限酵素とprimer設計なんぞと言う
なんか面倒な手技が絡んでくるようなので
細かく疑問点を聞きまくる羽目に。<
＜省略されました＞ [全文を見る]
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- 37: あ:2019/03/22(金) 09:16
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自分でも何がしたくて何をしなきゃいけないのか分かってないんだったら、独学なんて金も時間も浪費するやり方はやめたほうがいいですよ
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- 38: student:2019/03/22(金) 16:01
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>移動度の差で遊び実験
もしかして、制限酵素断片長多型を見ようとしてますか。
RFLPは検出にプローブが必要なので、自宅で検出するのは厳しそうな気がしますね。
「genomic DNAの多型をみる場合、そもそも制限酵素処理は必要ない」というのは、ゲノムDNA中の配列をPCRで増幅し、PCR産物をシーケンスにかけることを指したつもりで言いました。
この時には制限酵素処理などはいらないです。ゲノムDNAを鋳型にPCRをかけるのみ。
（PCR産物をサブクローニングするとかならDNAワーク必要ですが）
「海藻試料を渡して完全委託」はこのことだと思います。
ゲノムDNAを渡しても多分なにも結果が得られませんよ。
>自分でも何がしたくて何をしなきゃいけないのか分かってないんだったら、独学なんて金も時間も浪費するやり方はやめたほうがいいですよ
これを学ぶために、一度市民団体のハンズオン出るのもありな気がしますね。
業者に解析依頼すると結構お金かかると思いますし、そこのコストは自分の勉強だと思ってとってもいいのでは？
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- 39: ｈｊｎ:2019/03/23(土) 04:52
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読んだ文献にRAPD RFLP AFLPはどれも旧式で欠点だらけであると有る物が有りました。
また
DNAレベルでニンジン生薬の識別のために
簡易で再現性のある方法を開発することを目的として，
3種間の18S rRNA遺伝子塩基配列決定の違いをベースとした，
PCR-RFLP法とMASA法を適用した．
MASAはPCR機械と電気泳動装置ならびに反応試薬があれば比較的簡単であって、
適切なPCRプライマー設計とPCR条件の基礎検討を十分行なえば
再現性のよい高精度の結果が得られる（関谷1997）というのも。
面倒でない=step数が少ないのが良いのでMASAに気をひかれます。
私がやろうとしておることは用語を使えばRFLPですね、
ｒｂｃL、matK、ND5、COI、nrITSについての。
primerでうんざりしておるのにprobeなんてのも出てきましたかあ。
＞市民団体のハンズオン出るのもありな気がしますね。
そこのコストは自分の勉強だと思
たしかにね、とにかく手を動かさねば理解できませんから。
大学や国研でも無料で数年前にやってましたが、
来年度に有料に成るのは8千円と2万円とが明らかになっております。
無料のが6件くらいです
＜省略されました＞ [全文を見る]
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- 40: 助さん:2019/03/23(土) 12:06
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根本的な考え違いをされているようです。高等植物のゲノムサイズはどのくらいだとお思いですか？
通常のアガロースゲル電気泳動で分別することのできるDNAのサイズはどのくらいのレンジかご存知ですか？
それを典型的な制限酵素で切断したいくつに切れるか計算してみてはいかがでしょうか。
通常のDNAの電気泳動が目的なのだからMultiphor IIのことはもうお忘れになった方が良いですよ。
皆さん、何度もご指摘になっているのに、なぜそこに執着されるのでしょうか。
primerと制限酵素？PCR産物でRFLP解析するということですか？
RFLPは種内の系統解析には使えるでしょうが種間で比較しても意味があるとは思えません。
配列解析一択でしょう。
これらは目的とされている実験のデザインでは基礎の基礎であって、体で覚えるなどといったこととは無縁の話です。
悪いことは言いませんからプロと共同研究をなさることをお勧めします。
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