2020.05.07
自宅で自分でDIY新型コロナPCR診断をしよう(5)血液からのゲノムDNA抽出をやってみた
↓前回の続きです。
新型コロナをRT-PCRする前に、まずPCRがうまく出来ることを確認しようと難易度の少し低いゲノムPCRを自分の血液からDNAを抽出してやってみているところです。
↓血液の採取は好きな鋭利な刃物をぶっさせば良いと思いますが(笑)
先日手に入れた「ランセット」ってデバイスがよく出来ています。これならドキドキすることも痛い思いもせず、いくらでも血液ゲット出来る。
↓しかしランセットは少量の血液を採取するためのものなので1回50μLぐらいしかとれず結局4回もブシュっとする必要がありました。指先から滲み出た血液を絞り、マイクロピペットで適当なチューブに集めます。
↓ゲノムDNAの抽出プロトコールは前回の記事で紹介したとおりです。
↓やっと目的量の200μL集まりました。本当はこんなにいらないと思う。1滴あれば十分だとは思うんだけど。
↓前回小分けにして冷凍保存したタンパク質分解酵素Proteinase Kを冷凍庫から取り出します。手で握るとあっという間に溶けます。
↓プロトコールに従い20μL加えます。50μLずつ小分けにしてあって今回20μL使い、残りは再冷凍、1回ぐらいの凍結融解は平気だろう。
↓さらにプロトコールに従いキット付属のGB Bufferを200μL加えます。書いて無いけどたぶん界面活性剤の入った液体でしょう。
↓プロトコールでは「ボルテックス」という器具でよく混ぜるように書いてあるのですが、うちにはそんなもの無いので指先でペンペンと何度もタッピングしてよく混ぜます。深緑のアヤシイ色になりました。
↓プロトコールに従い60℃で10分間温めます。
↓その後400μLの無水エタノールを加えます。この実験用に確保している無水エタノールは現在品薄らしくツマに新型コロナ対策用に狙われているで、使い終わったら元の隠し場所に戻します。
↓次にキット付属のDNA抽出カラムを使います。黄色いパーツがDNAをトラップするフィルター、たぶん化学的特徴のない単なるフィルターでエタノールを加えて析出したDNAを物理的にトラップしているだけなんじゃないかと予想。白いパーツは遠心する時の廃液を集めるチューブです。原理を考えるとアホらしいけど、まあ100個で1万円だから許せるかな。
↓左からサンプル、フィルター、廃液チューブです。
↓フィルターを廃液チューブにはめ
↓サンプルを注ぎます。フィルターは非常に目が細かいため遠心でもしないと液体は透過しません。どれぐらいの目の細かさのフィルターが知りたいところです。
↓全てのサンプルを加えました。
↓さて遠心分離します。
遠心機は↓
4000rpm、500xgまでいけて1500円。プロトコールでは8000rpm（1分間に8000回転）と書いてあるけどまあイケるだろ。
うわ、バランスがあってないせいで、壊れそうな低音の振動がします。全てのパーツがプラスチックで出来ている安遠心機なので大切に扱わないと。
電子天秤を使って厳密に重さを併せてから再度遠心することにします。
きちんとバランスを合わせると振動は減り、心なしか遠心速度も上昇したような気がします。
↓手持ちの遠心機は速度コントロールとか出来ませんが、この遠心機で30秒ほどで綺麗に濾過されました。ほらイケた。
↓次にプロトコールに従いWA1 bufferを500μL加えて再度遠心します。
↓少し色の薄まった廃液が出てきました。
↓プロトコールに従いW2 Bufferを加えて遠心します。
↓完全に透明になりました。DNAはフィルターにひっかかった状態のはずで、DNAのみがフィルターに残された状態になっているはずです。つまりDNAのみを分離出来ました。
↓次に廃液受けチューブを外し、DNA回収用の少し小さなフタ付きのチューブをハメます。
↓DNAを溶かしフィルターから溶出するためのEA bufferを200μL加え、1分待ってDNAが溶かした後に再度遠心。
↓自分の血液からゲノムDNAだけを抽出出来ました。とはいっても完全透明の液体。本当にゲノムDNAが週出出来たかどうかはこの段階では分かりませんが、とりあえずしっかりとラベルを貼り冷凍保存しておきます。液体は透明と言っても目視で少し着色しているのが分かるので少し洗浄が足りない気もします。W2 bufferでの洗浄をもう1回ぐらいやっても良いかもだけどキットには必要量しか含まれてないだろうから悩みどころです。
さて次にこのゲノムDNAを使ってPCRを行ってみます。具体的には「X染色体」と「Y染色体」特異的なプライマーを用意してあるので、俺が本当に生物学的にオトコかどうか確認してみたいと思います(笑)
あと昔購入した「アルコール分解酵素の遺伝子多型を調べるプライマー」も家のどこかに転がっているはず。
自宅で自分でPCRしたいな思ってからもう6年か。ここまで来るのに長かった。今や自室に全ての必要な試薬、機器が揃っています。
なお下記は実際に自宅でDIYバイオしてみて実験環境として改善が必要だなと思った点です。
めざせ快適自宅DIYバイオ環境。
Category:DIY自己医療
※当サイトで実施している実験において使用している試薬・機器は全て一般の人が購入・入手可能なものです。入手方法は過去に紹介されているはずですが、見つけられない場合はコメント欄等でお問合せください。
コメント
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001 [05.07 16:46]ふぇちゅいんさんふぁん(ゆるりゆラリー)★81:https://news.livedoor.com/article/detail.... コロナ届「日本ついにデジタル」 米紙、ファクス脱却と報道 ＞ ふぇちゅいんさん朗報です！ 日本がコロナ対応において、ついに先進国に追いつきました。 ↑(152)
002 [05.07 22:23]ギブリィ:古くからのブロガーのくつ王さんは個人でPCR検査するのやめようよぉと言っていますよhttps://news.yahoo.co.jp/byline/kutsunas.... ↑(129)
003 [05.07 22:55]ふぇちゅいん(管理人) TW★75:そのキットの配布で新たに見つかる感染者と、このキットで出た偽陰性で見逃される感染者の数どちらが多いと思いますか？ ↑(155)
004 [05.07 23:02]ふぇちゅいん(管理人) TW★75:目前に現れる患者しか見えない感染性専門医なんでしょうか？ ↑(120)
005 [05.08 23:33]試験管@Biglobe:ベイビーまだか？ ↑(123)
006 [05.10 22:08]グロ@Biglobe:指が生理痛みたいだけど。血はグロいからやめようぜ ↑(128)
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